Histotechnology

22/08/2025

22/08/2025

In histotechnology, mounting media refers to the substance used to mount a stained tissue section onto a microscope slide and preserve it under a coverslip for microscopic examination. It's a crucial step that ensures optical clarity, long-term preservation, and protection of the specimen.

🔬 Purpose of Mounting Media:

Preserves the stained tissue.

Protects the tissue from physical damage and fading.

Enhances optical clarity for microscopy.

Secures the coverslip in place.

🧪 Types of Mounting Media:

There are two main categories:

1. Resinous (Permanent) Mounting Media

Used after dehydration and clearing (usually xylene).

Hydrophobic (non-aqueous).

Examples:

DPX

Canada Balsam

Used for: H&E, trichrome, PAS, and other routine stains.

Pros: Long-term storage, excellent clarity.

Cons: Toxic solvents (xylene), longer drying time.

2. Aqueous (Temporary or Semi-permanent) Mounting Media

Water-based (no dehydration or clearing needed).

Used for: stains where lipids or enzymes might be destroyed by alcohol or xylene.

Examples:

Glycerin jelly

Apathy's medium

Mount-Quick Aqueous

Used for: fat stains (Oil Red O), enzyme histochemistry, immunofluorescence.

Pros: Faster, preserves certain stain types.

Cons: Not ideal for long-term storage (can dry out or allow microbial growth).

🧷 Mounting Process (for resinous media):

Stain the tissue section.

Dehydrate through alcohols.

Clear with xylene.

Apply mounting medium (1–2 drops).

Place coverslip carefully (avoid air bubbles).

Dry to harden the medium.

✅ Good Mounting Qualities:

Clear and transparent.

Compatible with the staining dyes.

Matches or nearly matches the refractive index of glass (about 1.5).

Durable over time (for permanent media).

19/08/2025

In a cytology lab, reports are usually written and signed out by the following professionals, depending on the country and the lab structure:

1. Cytotechnologists

They screen cytology slides (e.g., Pap smears, body fluids, FNAC smears).

They prepare a preliminary interpretation or descriptive report.

In many places, they can issue "negative for intraepithelial lesion or malignancy" reports for Pap smears under supervision.

Abnormal or suspicious cases are always referred to a pathologist.

2. Cytopathologists / Anatomical Pathologists

Medical doctors with specialty training in pathology.

They confirm the diagnosis and finalize the official report, especially for abnormal, atypical, suspicious, or malignant cases.

They are legally responsible for the final signed-out report.

18/08/2025

الخطوات الرئيسية لتحضير العينات النسيجية في معمل الهستوباثولوجي (Histopathology Laboratory):

🧪 خطوات تحضير العينات (Tissue Processing & Preparation)

1️⃣ استقبال العينة (Specimen Reception)

تسجيل بيانات المريض والعينة.

وضع label (باركود أو رقم) على العينة.

التأكد من أن العينة محفوظة في مثبت مناسب (غالبًا 10% Neutral Buffered Formalin).

2️⃣ التثبيت (Fixation)

الهدف: منع التحلل الذاتي والبكتيري وحفظ البنية النسيجية.

المثبت الأكثر شيوعًا: 10% NBF.

النسبة المثالية: 10 جزء مثبت : 1 جزء نسيج.

3️⃣ التقطيع (Grossing / Trimming)

يقوم الباثولوجي أو الفني بقص العينة إلى حجم مناسب (3–5 مم).

وضع القطع الصغيرة في كاسيت (Cassette) بلاستيكي خاص.

4️⃣ المعالجة النسيجية (Tissue Processing)

تمر بثلاث خطوات أساسية داخل جهاز Tissue Processor:

إزالة الماء (Dehydration): باستخدام كحول بتدرج تصاعدي (70% → 100%).

إزالة الكحول (Clearing): عادة باستخدام Xylene.

التشريب (Infiltration): بالـ Paraffin wax المنصهر.

5️⃣ التضمين (Embedding)

يتم وضع العينة المشبعة بالبارافين داخل قالب معدني وصب البارافين الساخن.

يترك ليبرد ويتجمد → يعطي بلوك شمعي (Paraffin block).

6️⃣ التقطيع بالمكروتوم (Sectioning)

استخدام جهاز Microtome لقطع شرائح رفيعة جدًا (3–5 ميكرومتر).

تنقل الشرائح إلى حمام ماء ساخن (Water bath) لتمددها.

تلتقط على شريحة زجاجية (Slide).

7️⃣ التثبيت على الشرائح (Slide Drying)

تجفيف الشرائح في فرن (Oven) عند 37–60°C لتثبيت المقطع على الشريحة.

8️⃣ الصبغ (Staining)

الصبغة الروتينية: Hematoxylin & Eosin (H&E) → لإظهار النوى والسيتوبلازم.

يمكن استخدام صبغات خاصة (Special stains) أو Immunohistochemistry عند الحاجة.

9️⃣ التغطية (Mounting)

وضع مادة شفافة (Mounting medium) على الشريحة.

تغطيتها بـ Coverslip للحماية.

🔟 الفحص والتشخيص (Microscopic Examination)

يقوم أخصائي الباثولوجي بفحص الشرائح تحت المجهر وكتابة التقرير التشخيصي.

18/08/2025

📊 مقارنة بين المثبتات

المثبتأهم الاستخداماتالمميزاتالعيوب10% Neutral Buffered Formalin (NBF)التثبيت الروتيني في الهستوباثولوجي (الأنسجة الموجهة للبارافين).- يحافظ جيدًا على البنية الخلوية والنسيجية.
- يخترق النسيج بسرعة.
- متوفر ورخيص.- التثبيت الكامل بطيء نسبيًا.
- لا يحفظ الدهون جيدًا.
- يمكن أن يسبب تحلل DNA/RNA إذا لم يحفظ بشكل مناسب.Glutaraldehydeعينات المجهر الإلكتروني (EM).- ممتاز في حفظ الأغشية والتراكيب فوق الخلوية.
- يثبت البروتينات بقوة.- بطيء النفاذ إلى داخل النسيج.
- غير مناسب للروتين.
- غالي وسام.Osmium tetroxide (OsO₄)يستخدم في EM خصوصًا لحفظ الدهون والأغشية.- أفضل مثبت للدهون.
- يعطي تباين عالي للإلكترونات (contrast).- سام جدًا ومكلف.
- لا يخترق العينات الكبيرة جيدًا.Alcohols (Methanol, Ethanol)- مسحات الدم (Blood smears).
- Cytology.- تجفف وتثبت بسرعة.
- تحافظ على الأحماض النووية.- تسبب انكماش الخلايا.
- لا تحفظ البنية الدقيقة للأنسجة.Mercurials (مثل Zenker’s fluid)أنسجة خاصة (الكبد، الطحال، نخاع العظم).- تحفظ التفاصيل الخلوية جيدًا.- سامة جدًا (تحتوي على زئبق).
- يصعب التخلص من النفايات.Heat fixationمسحات البكتيريا على الشرائح.- بسيط وسريع.
- يقتل البكتيريا ويثبتها.- يسبب تشوه البنية الخلوية.
- لا يصلح للأنسجة.

🔸 الخلاصة:

الفورمالين (NBF) → الأفضل للتثبيت الروتيني.

جلوتارالدهيد + OsO₄ → الأفضل للمجهر الإلكتروني.

الكحول → الأفضل للمسحات والسيتولوجي.

التثبيت الحراري → مناسب للبكتيريا فقط.

18/08/2025

🔹 تعريف التثبيت (Fixation)

هو الخطوة الأولى في تحضير العينات النسيجية، وتهدف إلى حفظ النسيج في حالته الطبيعية أقرب ما يكون للحياة، ومنع حدوث التحلل الذاتي (Autolysis) أو التعفن (Putrefaction).

🔹 أهداف التثبيت

منع التحلل الذاتي (Autolysis): عن طريق تثبيت الإنزيمات.

منع التعفن (Putrefaction): عبر قتل البكتيريا والفطريات.

الحفاظ على الشكل المورفولوجي: الخلايا والأنسجة تبقى قريبة من الوضع الطبيعي.

الحفاظ على المكونات الكيميائية: البروتينات، الدهون، الكربوهيدرات… إلخ.

تجهيز العينة للخطوات التالية: مثل المعالجة، التقطيع، والصبغ.

🔹 أنواع الـ Fixatives

تنقسم إلى مجموعتين رئيسيتين:

1. Chemical Fixatives (الأكثر شيوعًا)

Aldehydes:

فورمالين (10% Neutral Buffered Formalin – NBF) → الأكثر استخدامًا في الهستوباثولوجي.

جلوتارالدهيد → يستخدم خصوصًا في التحضير للمجهر الإلكتروني.

Alcohols: (إيثانول، ميثانول) → جيدة للدم والخلايا (cytology).

Oxidizing Agents: مثل Osmium tetroxide، Potassium dichromate.

Mercurials: مثل Zenker’s fluid.

2. Physical Fixatives

Heat fixation: (شائع في تحضير مسحات البكتيريا).

Microwave fixation.

🔹 العوامل المؤثرة في عملية التثبيت

حجم العينة: يفضل أن لا يزيد عن 4–5 مم لتسهيل نفاذ المثبت.

نوع المثبت المستخدم.

المدة الزمنية للتثبيت.

درجة الحرارة.

الـ pH والأسموزية (Osmolarity) للمثبت.

🔹 الأخطاء الشائعة

تأخير التثبيت → يسبب تحلل العينة.

استخدام حجم قليل من المثبت → يجب أن تكون النسبة على الأقل 10:1 (مثبت : نسيج).

اختيار مثبت غير مناسب لنوع الدراسة (مثلاً الفورمالين لا يحفظ الدهون جيدًا).

16/08/2025

الهيماتوكسيلين لوحده ما بيلون، لازم يرتبط بـ Mordant (مُثبِّت) علشان يتكون مركّب Hematoxylin–Mordant–Tissue.
ونوع الموردانت (Aluminum, Iron, Tungsten, Lead...) هو اللي بيحدد لون النواة وثبات الصبغة.

🔹 أنواع الهيماتوكسيلين حسب نوع الـ Mordant

Aluminum Hematoxylin (Alum Hematoxylin)

الموردانت: أملاح الألومنيوم (Alum).

اللون: أزرق إلى بنفسجي فاتح.

الاستخدام:

روتيني في H&E (مثل Harris, Mayer’s, Gill’s).

يعطي نوى واضحة لكن غير مقاومة للأحماض القوية.

Iron Hematoxylin

الموردانت: أملاح الحديد (Ferric salts).

اللون: أسود غامق إلى بنفسجي غامق.

الاستخدام:

عند الحاجة لمقاومة الأحماض (special stains).

مثال: Weigert’s Iron Hematoxylin في Masson’s Trichrome.

Tungsten Hematoxylin

الموردانت: أملاح التنجستن.

اللون: أزرق غامق مائل للأسود.

الاستخدام: نادر، بعض special stains.

Lead Hematoxylin

الموردانت: أملاح الرصاص.

اللون: أسود.

الاستخدام: قليل جداً في الروتين، أحياناً في الدراسات القديمة أو الخاصة.

📌 الخلاصة:

Aluminum mordant → لون أزرق/بنفسجي → شائع في الروتين H&E.

Iron mordant → لون أسود/غامق → مقاوم للأحماض → يستخدم في special stains.

Tungsten/Lead → نادر الاستخدام حالياً.

16/08/2025

Hematoxtlin and Eosin
🔹 أولاً: مكوّنات الصبغة

الهيماتوكسيلين (Hematoxylin):

صبغة أساسية (Basic dye)، تصبغ الأنسجة الحامضية باللون الأزرق أو البنفسجي.

أكثر ما يظهر به: النواة (DNA & RNA)، الريبوسومات، الكروماتين.

يحتاج إلى mordant (عادةً أملاح الألومنيوم أو الحديد) ليثبت على النسيج.

الأيوزين (Eosin):

صبغة حامضية (Acidic dye)، تصبغ الأنسجة القاعدية باللون الوردي أو الأحمر.

أكثر ما يظهر به: السيتوبلازم، الكولاجين، الميتوكوندريا، كريات الدم الحمراء.

🔹 ثانياً: أنواع الهيماتوكسيلين

هناك عدة أنواع تختلف في تركيبة الموردانت (mordant) وزمن التحضير، منها:

Harris Hematoxylin

الأشهر في الروتين.

يعطي لون أزرق واضح للنواة.

Mayer’s Hematoxylin

أخف تركيزاً، يستخدم كثيراً في الصبغات المناعية IHC كـ counterstain.

Gill’s Hematoxylin (Gill I, II, III)

يعطي تباين ممتاز ووضوح للنواة.

يستخدم بكثرة في cytology (عينات السوائل والخلايا).

Weigert’s Iron Hematoxylin

مقاوم للأحماض، لذلك يستخدم في special stains مثل Masson’s Trichrome.

Delafield’s Hematoxylin

قديم نسبياً، يستخدم أحياناً في الدراسات التعليمية.

🔹 ثالثاً: أنواع الأيوزين

Eosin Y (الأكثر شيوعاً): تعطي لون وردي إلى برتقالي فاتح.

Eosin B: تعطي درجة وردية مزرقة.

🔹 رابعاً: استخدامات H&E

الفحص الروتيني للهستوباثولوجي

تشخيص كل أنواع الأورام والالتهابات والتغيرات النسجية.

إظهار البنية العامة للنسيج

توزيع الخلايا، النواة مقابل السيتوبلازم، الألياف، الأوعية.

كـ Counterstain في بعض الصبغات

مثل عند استخدام تقنيات مناعية (IHC) أو إنزيمية.

📌 الخلاصة:

Hematoxylin = نواة (أزرق/بنفسجي).

Eosin = سيتوبلازم ومواد بين خلوية (وردي/أحمر).

أهم صبغة روتينية وأساسية لا يمكن الاستغناء عنها في أي مختبر هستوباثولوجي.

16/08/2025

In Histotechnology, staining is one of the most critical steps because it enhances tissue contrast, making microscopic structures visible and distinguishable. Since most biological tissues are nearly transparent under the light microscope, staining provides color and specificity.

Here’s a structured overview:

🔹 1. Purpose of Staining

To differentiate cellular and tissue components.

To highlight specific structures (nucleus, cytoplasm, fibers, microorganisms, etc.).

To assist in diagnosis by pathologists.

🔹 2. Types of Stains in Histotechnology

A. Routine Stains

Hematoxylin & Eosin (H&E):

Most common stain (“routine stain”).

Hematoxylin: stains nuclei blue/purple.

Eosin: stains cytoplasm, muscle, collagen pink/red.

B. Special Stains

Used to identify particular tissue components. Examples:

Periodic Acid-Schiff (PAS): glycogen, mucin, basement membrane.

Masson’s Trichrome: connective tissue vs. muscle.

Silver Stains (Reticulin, Gomori, Jones): reticular fibers, fungi, basement membrane.

Congo Red: amyloid (shows apple-green birefringence under polarized light).

Ziehl-Neelsen (ZN): acid-fast bacteria (e.g., Mycobacterium).

C. Histochemical Stains

Based on chemical reactions within tissue.

Examples:

Prussian Blue: iron.

Sudan Black / Oil Red O: lipids.

Alcian Blue: acidic mucins.

D. Immunohistochemistry (IHC)

Uses antibodies to detect specific antigens (proteins).

Example: Estrogen receptor (ER) in breast cancer.

E. Fluorescent Stains

Fluorescent-tagged dyes or antibodies viewed under fluorescence microscopy.

Example: DAPI stains DNA (nuclei blue).

🔹 3. General Steps in Staining

Deparaffinization & Hydration (for paraffin sections).

Staining with dyes (single or multiple).

Differentiation (removing excess stain).

Dehydration (through alcohols).

Clearing (xylene or substitute).

Mounting (with coverslip for preservation).

🔹 4. Factors Affecting Staining Quality

Fixation quality.

Thickness of section (usually 3–5 µm for light microscopy).

pH and temperature of stain.

Timing of staining steps.

📌 In short: staining in histotechnology is the art and science of giving life to tissues under the microscope—transforming transparent structures into a vivid map for diagnosis and research.

16/08/2025

🧪 خطوات عمل Cell Block Technique

1. تحضير العينة

استلم السائل (Pleural, Ascitic, Urine, BAL, …).

سجّل بيانات المريض والعينة.

إذا كان الحجم كبير (50–200 ml) يكون أفضل.

2. الطرد المركزي Centrifugation

ضع العينة في أنابيب طرد مركزي.

دورها على سرعة 1500–2000 rpm لمدة 5–10 دقائق.

تخلص من السوبرنات (supernatant) واحتفظ بالـ pellet (الرواسب الخلوية).

3. تحضير الجلطة الخلوية (Cell clot / pellet fixation)

هناك أكثر من طريقة:

🔹 الطريقة التقليدية (Plasma–Thrombin method):

أضف قطرة بلازما + قطرة ثرومبين للرواسب.

حيحصل تجلط → تتكون كتلة صغيرة فيها الخلايا.

🔹 طريقة Agar:

امزج الرواسب مع محلول agar دافئ.

ضعها على شريحة صغيرة لتتجمد → تتكون كتلة متماسكة.

4. التثبيت Fixation

ضع الكتلة (clot) في فورمالين 10% لمدة 6–12 ساعة (أو حسب البروتوكول).

5. المعالجة Processing

أدخل الكتلة في الكاسيت (Tissue cassette).

مررها في خطوات المعالجة الروتينية (Dehydration → Clearing → Paraffin infiltration).

6. التضميد Embedding

ضُمّن الكتلة في شمع البرافين مثل أي عينة نسيج.

بعد التبريد تتكون كتلة برافينية Cell Block.

7. القطع Sectioning

اقطع مقاطع بسمك 3–5 ميكرون باستخدام الميكروتوم.

ضعها على شرائح زجاجية.

8. التلوين Staining

التلوين الروتيني: H&E stain.

يمكن عمل Special stains (مثل PAS, Mucicarmine, ZN stain).

يمكن تطبيق Immunohistochemistry (IHC) لتحديد نوع الخلايا (مثلاً Cytokeratin, CD markers…).

✅ المخرجات النهائية:

شريحة تشبه النسيج العادي، لكن مصدرها عينة سائلة.

تساعد الطبيب الباثولوجي على التشخيص بدقة عالية.

16/08/2025

تقنية Cell Block أو ما يُعرف بـ “كتلة الخلايا” هي إحدى الطرق المهمة في علم الخلايا (Cytology)، وتستخدم لتحويل العينات السائلة (مثل سوائل الجسم أو غسالات الأنسجة أو الرشحات) إلى مقاطع نسيجية شبيهة بالـ Paraffin Block، بحيث يمكن التعامل معها مثل عينات الأنسجة العادية في علم الـ Histopathology.

🔹 مبدأ التقنية:

يتم جمع الخلايا من العينات السائلة.

تركيزها عبر الطرد المركزي.

مزجها مع مادة داعمة (مثل البلازما + الثرومبين، أو الجيلاتين، أو agar) لتكوين "جلطة خلوية".

تثبيتها بالفورمالين ثم تمر بمراحل المعالجة الروتينية (Processing → Embedding → Sectioning → Staining).

🔹 أهمية وميزات Cell Block:

الحفاظ على البنية المعمارية للخلايا (بدلاً من انتشارها العشوائي في الـ Smears).

إمكانية عمل صبغات خاصة (Special stains).

إمكانية تطبيق تقنيات مناعية (Immunohistochemistry – IHC).

زيادة حساسية ودقة التشخيص في عينات سوائل الجسم (مثل Pleural fluid, Ascitic fluid, CSF).

مفيدة في تشخيص الأورام، حيث تسمح بتحديد المنشأ النسيجي للخلايا الورمية.

🔹 أمثلة لاستخدامها:

سوائل الجنب (Pleural effusion) → للكشف عن الخلايا السرطانية.

سوائل البطن (Ascitic fluid).

البول (Urine cytology).

غسالات الشعب الهوائية (Bronchoalveolar lavage).